L-色氨酸(L-tryptophan， L-Trp)是20种卵白质氨基酸中的一种，亦然哺乳动物所必需的氨基酸。色氨酸，笔名α-氨基-β-吲哚丙酸，是一种在碱性条款下结识的晶体，于1901岁首度被Hopkins发现并分离得到。色氨酸共有3种同分异构体，L-色氨酸、D-色氨酸及两种异构体的消旋羼杂物DL-色氨酸，而唯有L-色氨酸参与东谈主体的代谢功能。L-色氨酸是组成体卵白的进军组成部分，参与调控卵白质的合成、脂肪代谢，同期与其他物资，如碳水化合物、维生素和微量元素等的代谢调控也有着颠倒良好的关系[1]。因此，L-色氨酸是生物体内进军的代谢产物，在生理和代谢过程中具有至关进军的作用。现在L-色氨酸在医药、食物和饲料等规模被平庸应用。在医药规模，L-色氨酸不错行为药物平直在临床中使用[2]，也不错行为前体用于一些药物的出产，如紫色杆菌素[3]；在食物规模，L-色氨酸不错行为食物添加剂起到补充养分、调味和防腐的作用；在饲料规模，L-色氨酸不错行为添加剂加入到饲料中，以达到提高篡改率和滋长速率、缩短应激性、提高免疫力等目的[4]；在其他方面，字据其性质，L-色氨酸不错应用到化妆品、环境检测和农业等规模[5-7]。抛弃现在，L-色氨酸的商场需求依然进步了28 000 t/年，且该产物的商场限制仍然在不断扩大。但是，较为落伍的出产工夫导致L-色氨酸的出产资本高、产量较低，进而端正了其更大限制的应用。因此韩国全色网，如何缩短出产资本、提高出产遵守，成为近几年该规模的商量要点。

L-色氨酸最早通过酪卵白水解和分离索取取得，是L-色氨酸工业化出产的最早应用。但是，自然水解法出产L-色氨酸濒临着资本高、耻辱严重和工艺复杂等问题[8-9]，导致无法杀青大限制出产，而随后出现的化学合成法处置了部分问题，并取代了卵白水解法成为L-色氨酸出产的主流工艺。由于化学合成法出产门径繁琐，且对环境耻辱较大，也无法齐全保证产物的安全性，因此依旧需要更好的步伐进行更高效的出产。跟着生物工夫的发展，酶篡改法、微生物篡改法和微生物发酵法等杀青应用[10-12]。自然国内已有训练的酶篡改法出产L-色氨酸的关系报谈[13]，但酶篡改法对原料需求较大，底物L-丝氨酸价钱接力，险些与L-色氨酸相当[14]。同期，酶容易在出产过程中失活，不利于大限制出产，而微生物篡改法的不及之处在于当篡改液中前体物浓度较高时，篡改率有所下落。另外，前体物价钱比较贵，也不利于缩短资本[12]。因此自然以上两种篡改法皆依然领有一定的工业化产业限制，但是无法灵验缩短出产资本，杀青更大限制的应用。比较酶和微生物篡改法，通过大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌等构建出产菌株并平直发酵产生L-色氨酸的微生物发酵法具有资本低、工艺环保、细胞密度高和出产遵守高[15]等特色，将是改日L-色氨酸工业化出产的首选工夫[16]，亦然现在该规模的主要商量方针[17]。

1 L-色氨酸的合成代谢与调控

由于L-色氨酸在细胞内代谢阶梯繁多，其生物合成阶梯受到多水平的高度调控，很难在细胞中杀青高浓度的积贮，通过自然筛选难以得到具有较高产量的自然出产菌株，这也极地面提高了通过代谢立异等取得高产菌株的难度[18]。长久以来，关于高产L-色氨酸菌株的构建一平直受偶然诱变和选用的步伐，但这种步伐产生的遗传配景通常不解确[19]。自然现在在高效L-色氨酸菌株的构建过程中，已平庸使用了代谢工程、合成生物学等步伐，况兼已取得了一系列的进军遵守，但L-色氨酸发酵出产仍存在菌株出产强度不高、环境耐受性差、出产遵守低等卓著问题，这导致其出产资本仍旧较高[20-21]。因此，需要久了意志L-色氨酸的合成代谢与调控机制，为构建高效出产菌株奠定基础。

1.1 微生物合成L-色氨酸的代谢阶梯

自然通过谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌等细菌出产L-色氨酸的步伐均有报谈，但现在依旧以大肠杆菌出产为主。在大肠杆菌中，L-色氨酸的代谢阶梯如图 1所示，不错分为以下3个部分的代谢阶梯。

1.1.1 前体物代谢阶梯

L-色氨酸生物合成需要2个最进军的物资：赤藓糖-4-磷酸(erythrosis-4-phosphate， E4P)和磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate， PEP)，二者分裂由行为肇始物资的葡萄糖通过磷酸戊糖阶梯(hexose monophosphate pathway， HMP)和糖酵解阶梯(Embden-Meyerhof-Parnas pathway， EMP)形成，随后，E4P和PEP在3-脱氧-α-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶的催化作用下形成3-脱氧-α-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(3-deoxy-d-arabino- heptulosonate-7-phosphate， DAHP)。一般以为，PEP和E4P这两个前体物的供给材干对L-色氨酸的代谢具有决定性作用，其平直决定了干涉芳醇族氨基酸共同阶梯(或者也称为莽草酸阶梯)的物资流量[7]。

1.1.2 芳醇族氨基酸共同阶梯

DAHP在共同阶梯中经过一系列酶催化响应，前后分裂形成3-脱氢莽草酸(3-dehydroshikimate， DHS)、莽草酸(shikimate， SHIK)和5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate， ESPS)等物资，最终形要素支酸(chorismic acid， CHA)并分裂干涉L-色氨酸、L-酪氨酸和L-苯丙氨酸分支阶梯[22]。芳醇族氨基酸共同阶梯使植物和微生物将碳水化合物的代谢与芳醇族化合物的生物合成关联，对微生物具有进军酷爱酷爱，也对L-色氨酸生物合成有进军的影响。

麻豆 艾鲤 1.1.3 L-色氨酸分支阶梯

CHA在分支阶梯中不错干涉L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸分支阶梯中的一个阶梯，并经过各自代谢阶梯生成相应的芳醇族氨基酸。在CHA合成L-色氨酸过程中，醋酸厌氧酮(anorethisterone acetate， ANTA)和5-磷酸核糖基邻氨基苯甲酸(5-phosphoribosylanthranilate， PRANT)按序被邻氨基甲酸合成酶-磷酸核糖篡改酶复合物分裂催化；邻氨基甲酸合成酶由2个亚基组成，大亚基TrpE参与CHA和氨篡改为ANTA的过程，小亚基TrpD起到提供氨基和参与PRANT合成的作用；随后，trpC编码的PRANT异构酶将PRANT篡改为吲哚-3-甘油磷酸(indole-3-glycerol phosphate， I3GP)，I3GP和L-色氨酸再被由trpA和trpB编码的色氨酸合成酶复合物催化生成甘油醛-3-磷酸和L-色氨酸[23]。

1.2 L-色氨酸合成的代谢调控

分析L-色氨酸的关系代谢阶梯，发现其在细胞内的合成具有代谢阶梯长、代谢去路多、转运与调控机制复杂的特征。同期胞内L-色氨酸过量积贮将突破细胞自身代谢均衡，导致细胞过度抒发或扼制某些生物分子，从而对细胞产生毒反作用，最终扼制细胞的滋长[23-24]。因此，由于过量的L-色氨酸将对细胞变成的生理毒性，L-色氨酸的多半合成进一步受到端正。

1.2.1 严谨的反馈调理

如上文所述，L-色氨酸在细胞内的浓度不错通过影响细胞内酶的活性和转录的步伐达到抨击L-色氨酸进一步在细胞内合成的目的。

最初，DAHP合成酶的活性在胞内L-色氨酸、L-酪氨酸或L-苯丙氨酸浓渡过高时受到扼制，反馈调理旨趣如图 2所示[25]。DAHP合成酶是代谢阶梯的限速酶，组成该酶的3个同工酶分裂由aroG、aroF和aroH基因编码，它们的活性分裂受到酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的调控，其中aroG对DAHP合成酶的催化活性最佳，在80%足下[26]。相应氨基酸浓渡过高将扼制DAHP合成酶的活性，减少干涉共同阶梯的碳流量。此时细胞内后续的共同阶梯所需的前体物资将减少，最终缩短L-色氨酸合收遵守。其次，上述氨基酸对芳醇族氨基酸共同阶梯中的一系列酶的活性和关系卵白的合成皆具有浮现的调控作用，通过端正共同阶梯的代谢流量减少了多种氨基酸的过度聚会的可能。终末，单种氨基酸好像在分支阶梯中对相应酶活性产生反馈扼制，L-色氨酸、L-酪氨酸和L-苯丙氨酸之间的浓度关系将平直影响CHA干涉不同分支阶梯的数目，从而幸免了单一氨基酸的过度积贮。

有报谈指出[27-29]，邻氨基苯甲酸合成酶(TrpED)、分支酸异构酶(PheA)和预苯酸脱水酶(TyrA)在分支阶梯中禁止CHA的代谢行止，分裂起到催化作用并受到L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的反馈扼制。这些催化酶在氨基酸合成中起到调控作用，端正了多半氨基酸在胞内的多半累积。

另外，有商量指出[30-31]，色氨酸驾御子是大肠杆菌将CHA篡改为L-色氨酸的主导调控因子，trpR基因是这个驾御子的上游基因之一，编码trpR装璜卵白。在菌体中的L-色氨酸浓渡过高时，通过trpR装璜卵白的作用，驾御子的转录遵守将被缩短。同期，色氨酸驾御子的序列中包含了一段衰减子序列，在菌体内的L-色氨酸浓渡过高时，这段序列将通过改变二级结构扼制驾御子的转录。

在细胞内L-色氨酸浓渡过高时扼制相应酶的转录和活性是菌体对自身的一种保护机制，幸免了氨基酸的过度聚会搅扰细胞的代谢均衡，从而保合手细胞的代谢活性。但是，这也加大了提高细胞内L-色氨酸积贮的难度，通过撤消某个单一酶的来自L-色氨酸的反馈扼制作用，无法杀青L-色氨酸产量的多半提高。

1.2.2 降解阶梯繁多

L-色氨酸在胞内的代谢去路繁多，这与其在细胞内的进军功能相关。L-色氨酸在卵白质内的含量低于1%，但对卵白质的合成至关进军，因而卵白质合成是L-色氨酸的主要瓦解阶梯之一。此外，L-色氨酸在细胞中的代谢产物对细胞的平淡代谢起到进军作用，与细胞增殖等基本功能有平直关系，如合成5-羟色胺及褪黑素、犬尿氨酸-烟酸阶梯瓦解代谢阶梯，皆会消费多半L-色氨酸，使得L-色氨酸的积贮贫苦。

细胞对L-色氨酸合成代谢的另一进军调控阶梯在于，当细胞内L-色氨酸浓渡过高时，色氨酸酶(tnaA基因编码)会起到降解L-色氨酸的作用，使得L-色氨酸在细胞内的积贮变得贫苦。

1.2.3 转运系统端正

L-色氨酸通常被细胞高效的接收系统接收，同期细胞清寒高效的L-色氨酸外排系统，使L-色氨酸的胞外积贮受到影响。在大肠杆菌中，有3个转运基因不错对L-色氨酸的接收起到调控作用，分裂是mtr、tnaB和aroP基因，其中，mtr和tnaB基因分裂编码两种亲和性不同的通透酶，这两种酶对L-色氨酸皆具有专一性。由aroP基因编码的转运酶对L-色氨酸莫得专一性，它也不错转运L-酪氨酸和L-苯丙氨酸。同期，谷氨酸棒杆菌对L-色氨酸的接收齐全由aroP基因调控。但是现在对L-色氨酸的外排系统的商量仍未能浮现主张其机理，调控步伐尚不可知。

2 L-色氨酸出产菌株构建

为构建高效出产L-色氨酸的菌株韩国全色网，商量者针对端正L-色氨酸合成的主要因素，接受传统的诱变育种和多种代谢工程计谋对菌株进行了系统立异优化，现在依然取得了一系列卓有收效的遵守。

2.1 增强前体物资合成

上文提到，L-色氨酸在细胞内领有多门径且复杂的合成阶梯，所需要的前体物资繁多。然则，这些前体物资在细胞内又平庸参与多样物资的代谢响应。因此，增强细胞内前体物资的合成或端正前体物资在其他代谢阶梯中的消费是增强L-色氨酸合成材干的灵验步伐(图 2)。Li等[32]通过优化前体供应和调理扶植因子均衡的步伐将大肠杆菌L-色氨酸出产菌的产量提高了276%；陈立平[33]通过对大肠杆菌L-色氨酸出产菌进行诱变筛选，使L-色氨酸产量达到55.1 g/L；熊博[34]通过对大肠杆菌L-色氨酸工程菌的代谢优化，得到一株40 h内L-色氨酸产量达到约42 g/L、糖酸篡改率达到约0.23 g/g的L-色氨酸出产菌。

2.1.1 促进DAHP合成

DAHP合成速率的提高是增多干涉共同阶梯的碳流量的错误(图 2)，亦然促进L-色氨酸在细胞内过量累积的可行步伐。

行为DAHP合成的前体物资，通过促进PEP和E4P的合成不错提高DAHP的合成速率。在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中，磷酸篡改酶系统(carbohydrate phosphotransferase system， PTS)起到葡萄糖转运和磷酸化过程的作用，吴晨等[35]和吴涛等[36]通过对PTS系统的立异加强了对葡萄糖的转运，分裂将L-丙氨酸的产量提高到59.00 g/L、L-色氨酸的产量提高25.9%。行为进军的中间代谢物，PEP在细胞内的代谢阶梯繁多，流入芳醇族氨基酸共同阶梯的PEP数目较少，故商量东谈主员主要立异责任聚会在减少PEP在其他代谢阶梯的流出，及增多PEP在芳醇族氨基酸共同阶梯的流入。由于细胞内E4P的合成较少，远低于PEP，故提高E4P的合成是立异的进军计谋。细胞中PEP合酶(ppsA基因编码)平直作用于PEP的合成，碳贮存调理因子(csrA)则通过扼制ppsA的活性从而缩短PEP的合成速率，转酮醇酶(TktA)是合成E4P的错误酶。Xiong等[21]通过再行分拨中心碳代谢的神色，提高了大肠杆菌L-色氨酸出产菌的PEP和E4P含量，最终得到发酵40 h时L-色氨酸产量达到41.7 g/L的出产菌株。Tatarko等[37]通过敲除csrA基因和过抒发tktA基因的神色，分裂使卑鄙的L-Phe的产量提高2倍和1.4倍。Du等[38]通过修改大肠杆菌的中心代谢阶梯，增强了PEP的浓度，将菌株的L-色氨酸产量提高至约49 g/L。Yakandawala等[39]和路丽君等[40]则分裂证实了扼制csrB基因的抒发不错分裂提高细胞内L-Phe和L-色氨酸的产量。在这一过程中，部分商量淡薄了代谢副产物对细胞代谢均衡的影响[41]，这一阶梯的过度优化带来的后果是否能被细胞禁止仍需要磋商。pykA和pykF是丙酮酸激酶的两种同工酶，其中pykF起到了主要作用，其活性渊博于pykA[42]。Siddiquee等[43]通过敲除pykF基因缩短了大肠杆菌中丙酮酸通向PEP的流量。Li等[44]通过阻扰pykA和pykF保存了丙酮酸以出产4-HPA。Liu等[45]通过敲除pykA和pykF基因以增强SA的合成。在合成DAHP的过程中，E4P和PEP的消费呈固定比例，因为单一物资过多合成将导致代谢副产物的不消要积贮。为了处置这一问题，不错调理E4P和PEP的供应比例。Guo等[46]分裂用高抒发初始子抒发aroG和tktA，用中等抒发初始子抒发ppsA，最终使得立异菌株色氨酸产量提高16.4%，也证实了调理前体物的供应是提高L-色氨酸产量的进军神色。

DAHP合成酶的3个同工酶活性分裂受到相应氨基酸的扼制，Hagino等[47]发现当L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸同期存在时，其对DAHP合成酶的扼制作用不错达到接近90%，高于任何一种氨基酸单独存在的情况。因此，撤消或部瓦撤消氨基酸对DAHP合成酶的扼制是提高L-色氨酸产量的进军阶梯。郝大利等[48]通过对aroG基因进行定点突变，缩短了苯丙氨酸对aroG的扼制作用，得到一株色氨酸产量提高1.4倍的大肠杆菌。李晓萍等[49]通过DNA改选(DNA shuffling)构建了一株部瓦撤消苯丙氨酸反馈扼制的aroG的大肠杆菌。李明明[50]通过定点突变aroG基因并过量抒发ppsA和tktA基因的神色将莽草酸浓度提高6.22倍。

2.1.2 强化共同阶梯中的酶活性

在共同阶梯中，SHIK、EPSP及CHA等物资皆是进军中间代谢物之一(图 2)。自然依然有通过提高PEP和E4P产量的神色提高共同阶梯遵守的案例[50]，但共同阶梯中一系列酶的活性受限仍然是抨击其合收遵守的进军因素。部分商量通过加强关系基因的抒发增多了卑鄙物资的累积，而也有部分商量通过减轻部分基因的抒发减少了关系物资沿莽草酸阶梯的代谢，也从反面证实了这些基因的抒发卵白在共同阶梯中起到进军作用。Vitayakritsirikul等[51]通过过抒发委内瑞拉链霉菌的aroB和aroK基因，提高了CHA的产量，最终杀青了氯霉素产量的提高；Liu等[52]通过过抒发aroA和aroD基因使SA的产量达到原菌株的两倍，其中aroD对SA产量的提高效果最为浮现；马延和等[53]通过减轻aroE基因抒发，杀青了对DHS的代谢扼制；聂立斌等[54]敲除了谷氨酸棒杆菌的aroK基因，遏抑SHIK形成S3P，杀青莽草酸的积贮；Pan等[55]通过过抒发ydiB、aroK和yjgB (编码醛收复酶)基因，杀青了L-苯丙氨酸的过量出产；Schoenenberger等[56]对aroL基因重组，提高了S3P的合收遵守；汪莉等[57]通过敲除大肠杆菌的aroL和aroK基因，为细胞平直发酵出产SHIK奠定了基础；Fujiwara等[58]通过过抒发AroC和AroD基因增多了莽草酸阶梯的碳流量，使得卑鄙产物粘康酸产量提高。

2.2 增强L-色氨酸分支阶梯

在共同代谢阶梯后，L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸代谢阶梯皆不错行为CHA的代谢阶梯。因此，要提高L-色氨酸的产量，需要通过代谢调控的步伐使尽可能多的CHA流向L-色氨酸代谢阶梯。

2.2.1 阻断L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的代谢阶梯

上文提到，L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的合成阶梯分裂受到pheA基因和tyrA基因的端正，而这两种酶的活性又分裂被L-苯丙氨酸和L-酪氨酸反馈扼制。因此，阻断L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的代谢阶梯不仅不错使更多的CHA流向L-色氨酸阶梯，同期也不错减少这两种氨基酸在共同阶梯和中心代谢阶梯中的反馈扼制，而弱化pheA基因和tyrA基因的抒发或缩短这两种酶的活性是阻断L-苯丙氨酸和L-酪氨酸代谢阶梯的主要步伐。有著述报谈[59]通过向谷氨酸棒杆菌的tyrA基因座中插入aroG-pheA基因，从而缩短酪氨酸产量，提高L-苯丙氨酸的产量；Tanemura等[27]通过将鼠伤寒头陀氏菌的pheA和tyrA基因突变，减少了其trpD基因突变带来的影响，增多了L-色氨酸的产量；王钦[60]通过敲除大肠杆菌的pheA基因，将该工程菌的L-酪氨酸的产量由3.12 g/L提高到4.42 g/L；Xu等[61]证实了在零落pheA基因的情况下L-酪氨酸的产量不错得到显赫提高；蒋婕[62]通过敲除大肠杆菌的pheA和tyrA基因，显赫提高了trpD和trpE基因的抒发量。但是，上述部分报谈也发现由于代谢阶梯的阻断，出产菌成为养分颓势型菌株或细胞无法平淡滋长，因此，在减少这些分支代谢阶梯时，应尽量保证保管细胞生理活性的平淡代谢不受骚动。

2.2.2 通顺L-色氨酸分支代谢阶梯

除了去除以上两个分支代谢阶梯，也有商量通过增强L-色氨酸代谢阶梯的神色增多L-色氨酸的产量，主要的增强阶梯包括相应合成酶的反馈扼制撤消和过抒发。Zhao等[6]通过撤消trpED和aroF的反馈扼制并敲除pheA和tyrA等基因，将L-色氨酸的产量提高至13.3 g/L；郝大利等[48]将aroG基因与trpBA基因串联杀青过抒发，使大肠杆菌的L-色氨酸产量提高823%；Chen等[63]通过联想分析，发现提高L-谷氨酰胺细胞内的浓度有益于在一定进度上灵验撤消L-色氨酸的生物合成端正。另外，为了谢绝细胞中的L-色氨酸被合成为吲哚，应当缩短tnaA基因的抒发以减少色氨酸酶(TNase)的产生。Ding等[19]分析了大肠杆菌色氨酸出产菌的遗传特征，发现tnaA的缺失是最主要影响因素之一。在胞内L-色氨酸浓渡过高时，色氨酸驾御子通过缩短相应基因的转录和酶的活性减少CHA流入色氨酸阶梯，trpR是色氨酸驾御子中的错误基因之一。因此，敲除该基因有益于L-色氨酸在细胞内的进一步积贮。李剑欣等[28]向trpR和tnaA双基因缺失的大肠杆菌中加入抗反馈扼制的aroG及trpED基因，最终L-色氨酸含量为0.168 g/L；Aiba等[64]以trpR/tnaA双基因缺失的大肠杆菌为模板构建L-色氨酸出产菌株，产量达30 g/L。

2.3 立异转运系统

胞内L-色氨酸浓渡过高时，会搅扰细胞代谢均衡，对细胞产生生理毒性。因此，缩短L-色氨酸在细胞内的含量是提高L-色氨酸产量的错误因素之一。但是，由于现在对L-色氨酸的分泌机理仍不浮现，因此对转运系统的修饰主要聚会在接收阶梯的阻断。

马温华等[65]敲除了北京棒杆菌的aroP基因，将L-色氨酸的积贮量提高了65%；Liu等[66]阻扰了aroP基因，将大肠杆菌的L-色氨酸产量提高了13.3%；陈巧红[67]构建了trpR/tnaB双基因敲除菌并优化培养基，将L-色氨酸产量提高到145.3%；古鹏飞[68]通过构建AroP/TnaB双敲除菌株将L-色氨酸的产量提高至2.44 g/L，但mtr/AroP双基因敲除菌和mtr/tnaB双基因敲除菌的L-色氨酸产量下落浮现；李晶等[69]通过敲除mtr基因，将工程菌的L-色氨酸产量提高到35.87 g/L，是启程菌株的132%；赵志军等[70]通过敲除mtr. tnaB和mtr. aroP基因，L-色氨酸产量较启程菌株分裂提高17%和9%，但将mtr、tnaB、aroP这3个基因一起敲除后，菌体平淡调控受到阻扰，L-色氨酸产量急剧下落。

以上商量标明，自然弱化L-色氨酸的转运酶调控基因的抒发有益于部瓦撤消反馈扼制，但过度的转运功能如实会导致细菌难以平淡滋长，其基本生理功能被阻扰，反而导致L-色氨酸产量下落。因此，通过建树一定的模子细则相应基因敲除或弱化的神色，不错进一步提高L-色氨酸的产量。

yddG基因编码的分泌卵白是一种内膜卵白(inner membrane proteins， IMP)，是现在少数已知的大肠杆菌中不错分泌芳醇族氨基酸的卵白之一，yddG基因的过抒发有益于提高L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸的产量[71-72]。Liu等[73]通过过抒发yddG基因，将培养基中L-苯丙氨酸浓度增多，提高了L-苯丙氨酸的产量；Wang等[74]通过敲除大肠杆菌pta-mtr基因并过抒发yddG基因，使L-色氨酸的产量较启程菌株提高了48.68%；Liu等[75]通过基于tddG和aroP基因的修饰，使L-色氨酸生物合成阶梯的代谢通量再行漫步，其L-色氨酸产量达到了36.3 g/L。

以上增强前体物资合成等三种立异计谋主要聚会在大肠杆菌等细菌中，立异计谋主要汇总见表 1。

2.4 安妥进化提高L-色氨酸出产菌株性能

抛弃现在，色氨酸工程菌株所受到的合成歧路反馈扼制、色氨酸瓦解以及转运问题依然在一定进度上得到处置[76-77]，现在端正平直发酵法出产L-色氨酸的出产水平的一个进军因素是L-色氨酸在胞内过量积贮会对细胞产生生理毒性，因此提高菌株对高浓度L-色氨酸的耐受性对L-色氨酸的发酵出产具有要紧酷爱酷爱。由于零落高效转运卵白，通过加快胞内L-色氨酸的外排从而减少胞内L-色氨酸的毒理作用的步伐受到端正。而且高浓度L-色氨酸对菌株产生生理毒性的机制颠倒耐受机理未知，无法通过感性立异的步伐提高菌株对高浓度L-色氨酸的耐受材干。安妥进化(adaptive evolution)被平庸应用于提高菌株对产物的耐受性，况兼通过比较基因组学等步伐还可主张所得菌株的耐受机制，从而为菌株感性立异提供新计谋和新靶点。以丝氨酸为例，Mundhada等[24]对菌株进行安妥性进化，使菌株对丝氨酸的耐受性由3 g/L提高到100 g/L，丝氨酸积贮量为37 g/L，较启程菌株提高了3倍，对进化菌株进行全基因组测序发现thrA基因突变对减缓丝氨酸的细胞毒性有进军的作用。

2.4.1 传统安妥进化

安妥进化是联结东谈主工选用压力和模拟自然进化中的编译和选用过程，在实验室条款下杀青微生物的定向进化，达到从进化群体中筛选优良性状个体的步伐(图 3)。

安妥进化在微生物进化商量规模行为一种强有劲的技能，为商量影响工业出产菌株的部分因素(如表型、出产性能以及遗传结识性等)作出了巨大孝敬。相较于代谢工程需要澄澈菌体复杂的代谢网罗，安妥进化只需联想实验磋磨对应的骚动因素，具有平庸的微生物适用性和极强的实用性，在发现新机制、杀青表型优化证实着进军作用，在筛选特定表型、出产性能和遗传结识性的工业出产菌株等实验中被平庸接受，成为了微生物学商量的强盛器具。安妥进化字据使用需求不同，其主要应用不错分为以下4个方面：(1) 微生物代谢阶梯激活；(2) 微生物特定表型优化；(3) 特定底物的高效诈欺；(4) 毒性产物的耐受性优化[78]。

但是在一定条款下，安妥进化步伐并不可得到灵验证实，比如安妥进化在提高磋磨产物的出产时，会由于清寒合适的筛选步伐而难以杀青[79]；另外，在安妥性进化的过程中，尤其是当诈欺安妥进化的步伐提高菌株对磋磨产物的耐受性时，菌株合成磋磨产物的材干频频会部分或一起丢失[24]。细胞对磋磨产物的耐受机制是促使细胞缩短产物合成，这不错行为变成这种表象的一种解释。为处置访佛问题，有学者[79]联想建树菌株滋长和代谢物合成相偶联的算法，经过in silico预测后进行安妥性进化实验，产率皆得到了灵验提高。还有商量将生物传感器和滋长耦合并通过空间分离的步伐立异进化计谋，通过安妥进化的步伐提高磋磨产物的积贮[78]。

为特出到具有高L-色氨酸耐受性的出产菌株，同期保证菌株的L-色氨酸产量性状不发生丢失，不错选用接受高L-色氨酸压力筛选-发酵测定得到产量性状保合手菌株-更高L-色氨酸压力的进化神色完成对L-色氨酸出产菌株的进化和筛选，得到相应的高产菌(图 4)。同期不错通过测定进化菌的基因改变情况，主张其高产机理，最终回首感性的代谢立异得到更高产量的L-色氨酸出产菌株。

2.4.2 生物传感器联结

安妥进化自然不错在一定进度上处置色氨酸出产菌株产量性状丢成仇耐罹难以提高的问题，但现在仍濒临偶然性较强、责任量过大的贫苦。因此，要快速通过实验室安妥进化提高菌株对L-色氨酸的耐受材干，践诺上在于寻找一种高效筛选的步伐，以减少通过旧例发酵考证产量所需要的时分，从而大大减少得到具权术阵势菌株的时分。由于色氨酸是细胞代谢过程中的必需氨基酸，因此一些常用的筛选步伐能起到一定作用，举例通过划线分离的步伐寻找滋长速率较快的菌株，幸免分离得到养分颓势型或渗漏颓势型的菌株，从而得到具有平淡产量性状的菌株。但是，由于色氨酸出产菌中色氨酸的累积量本人就存在过量的表象，且对细胞滋长产生一定的毒性作用，同期除色氨酸外影响细胞滋长速率的因素繁多，难以摒除其他因素的骚动，因此有可能对筛选产生浮现的骚动作用。由此，得到一种不错平直耦连细胞特定性状和色氨酸产量性状的步伐十分必要。

生物传感器是合成生物学中平庸应用的元件，其不错通过感受相应物资的浓度大小从而调治卑鄙基因的抒发神色[80]。通过将合成生物学元件与安妥进化相联结，有益于细胞字据胞内色氨酸浓度的各异而抒发不同强度的特定性状，从而为高效筛选提供条款。举例，张大伟等[81]以tanC基因行为胞内色氨酸浓度的传感器，将荧光卵白基因和生物传感器进行联结，使得荧光卵白基因的抒发与细胞的色氨酸产量关联。字据实验表象，L-色氨酸在细胞内累积进度的提高将促进tanC基因的抒发，从而促进绿色荧光卵白(green fluorescent protein， GFP)的形成，最终导致荧光卵白GFP在细胞内浓度的增多，从而行为筛选条款之一。为了快速完成后续的筛选责任，细则可能具有产量性状提高的L-色氨酸出产菌株，实验接受了流式筛选的高通量筛选步伐，并以荧光值行为筛选条款进行筛选。最终，得到了一株L-色氨酸出产菌，相较于启程菌株，其L-色氨酸产量提高了约500%。总言之，上述实验的总体经由为：向启程菌株加入生物传感器和荧光卵白基因的组合质粒后经过诱变育种，偶然进行单细胞分离并字据菌液的荧光强度初步筛选可能具有高产性状的菌株，并进行进一步发酵考证。该实验以一株经过立异的色氨酸出产菌行为启程菌，相同经过常温等离子体(atmospheric room temperature plasma， ARTP)诱变这种非感性的诱变步伐，证实了将生物传感器行为筛选的扶植器具，抒发特定生物性状，有益于出产菌株在非感性立异后的筛选。

除了荧光卵白外，也不错使用菌落神志等因素行为特定性状进行筛选。此类步伐不错大大减少科研东谈主员的责任量，并达到高效筛选的目的。但是，由于筛选过程仍需细胞的分离和纯化，同期快速筛选需要使用高通量筛选征战，因此自然不错提高筛选速率，但仍较为烦琐。为简化筛选经由并得到具有关系产量性状的菌株，本实验室将眼神聚会于菌株产量性状与滋长性状的平直耦连。现在本实验室提议通过将生物传感器和抗生素基因联结的步伐，即在细胞内色氨酸浓度提高的同期，细胞相应抗生素抗性也得到浮现提高，即在安妥性进化后，以特定抗生素行为选用性培养基的错误要素，以细胞能否平淡滋长行为筛选依据和收尾，以此达到筛选磋磨性状菌株的目的。该实验决策处置了初步筛选过程中碰到的责任量过大的问题，同期将液体培养基中培养的菌液平直加入另一液体培养基中，在大大提高了筛选遵守的同期，使后续的菌株富集与筛选在吞并门径中完成。通过此实验决策，有望建树一套针对出产菌株产量性状的更高效筛选步伐，同期杀青菌株耐受性的提高和产量性状的结识，但愿在改日能取得一定效果。

3 色氨酸繁衍代谢物生物合成进展

以L-色氨酸为底物，在不同酶的催化作用下可生成多种具有寥落功能的色氨酸繁衍物，如滋长素、5-羟色胺、靛红和靛蓝等(图 5)，这些繁衍物对东谈主体健康皆具有进军作用，它们的产业化出产和应用具有极高的经济价值和社会效益。在较长的一段时安分，由于前体L-色氨酸在胞内难以累积，此类物资难以通过微生物多半合成，因此通过微生物发酵法进行工业出产受到端正。但是，经过上述对L-色氨酸出产菌的立异，大肠杆菌在细胞内累积L-色氨酸的问题依然得到部分处置，从而为通过大肠杆菌发酵出产L-色氨酸奠定基础，而如何进一步提高L-色氨酸繁衍物产量是改日应珍惜的要点。

3.1 5-羟色胺生物合成进展

色氨酸经色氨酸5-羟化酶(tryptophan 5-hydroxylase， TPH)催化生成5-羟色氨酸，再经色氨酸脱羧酶(tryptophan decarboxylase， TDC)催化生成5-羟色胺(5-hydroxytryptamine， 5-HT)，5-HT笔名血清素，它在动物中可行为神经递质，具有抗氧化、抗炎和抗动脉粥样硬化功能，药用价值颠倒丰富。Park等[82]通过在大肠杆菌中异源抒发TDC和色胺5-羟化酶(T-5H)这两个错误生物合成酶，制备了5-HT，收尾标明，该菌株可出产24 mg/L的5-HT。TyrR由tyrR基因编码，不错扼制芳醇族氨基酸共同代谢阶梯的合收遵守。N-肉桂酰血清素则是血清素的一种繁衍物，Lee等[83]通过在敲除了tyrR基因的出产菌中过抒发T-5H，使得其合成血清素而不进一步合成N-肉桂酰血清素。这些商量皆为以L-色氨酸为前体合成5-HT提供了鉴戒和参考。

3.2 靛红和靛蓝生物合成进展

吲哚是细胞内L-色氨酸的主要代谢阶梯之一，因此在L-色氨酸出产菌中，频频减轻tnaA的抒发或敲除该基因，以减少吲哚在细胞内的合成，促进L-色氨酸在细胞内的累积。靛蓝和靛红皆是吲哚的进军繁衍物之一，具有平庸的应用。

东谈主类诈欺靛蓝依然具有悠久的历史，产靛蓝的植物在传统医学中证实进军作用，同期靛正本人也能行为一类自然的染料，对衣饰、器物等进行染色[84]。但靛蓝的出产工艺从最早的自然索取到以化学合成为主，自然处置了资本较高、杂质难以去除的问题，但由于部分危急化学物资残留，导致产物的安全性无法保证[85]。靛红行为另一种吲哚繁衍物，不仅在抗艾滋病、抗细菌等方面有进军活性，也与其他吲哚繁衍物的合成有进军关系。

色氨酸是吲哚的前体物资，因此吲哚繁衍物的合成在含有较高浓度的L-色氨酸时具有更高的遵守。Gui等[86]构建了一株含有fmo基因的大肠杆菌出产菌，该出产菌株能在含有2 g/L色氨酸的培养基中产生223.6 mg/L的靛蓝，同期在加入0.36 g/L的半胱氨酸时，细胞的靛红产量大大提高。Du等[87]通过增多fmo基因和tnaA基因的产物浓度，完成了靛红的合成，立时通过敲除trpR基因、过抒发tktA基因等步伐，使细胞通过葡萄糖发酵出产靛蓝素的产量达到0.056 g/L。

3.3 褪黑素生物合成进展

褪黑素(N-乙酰基-5-甲氧基色胺)在生物体中漫步平庸，同期具有促进东谈主体就寝、抗虚弱等功能，受到越来越平庸的珍惜[88]。褪黑素在生物体内合成阶梯繁多，但行为吲哚杂环类小分子，其合成阶梯皆以L-色氨酸为前体，同期每条合成褪黑素的阶梯皆会经过5-羟色胺这一中间代谢产物，因此5-羟色胺的浓度将平直影响褪黑素的合收遵守[89]。Luo等[90]通过向大肠杆菌中导入异源芳醇氨基酸脱羧酶基因ddc，并定向进化编码色氨酸羟化酶的基因trpH，得到的出产菌株褪黑素产量达到2 g/L，同期，通过敲除yddG基因并外部补充L-色氨酸的实验，证实了L-色氨酸浓度的增多对褪黑素的高效合成具有进军作用。

4 L-色氨酸发酵出产优化

通过代谢工程的步伐对L-色氨酸出产菌进行感性代谢立异或通过实验室安妥进化等步伐进行非感性立异，这些皆是基于细胞代谢阶梯的角度，除此以外，优化培养基或培养条款、优化索取工艺等步伐也被平庸使用以增多L-色氨酸的产量(表 2)。

4.1 培养基与培养条款优化

由于工程菌株的代谢通路被改变，原先使用的培养基和培养条款可能会变成代谢副产物过多、pH与溶氧等条款不相宜、养分元素不及等问题，导致出产菌活力下落、出产遵守缩短，不适用于出产发酵环境。因此，探索更为合理的发酵条款有益于L-色氨酸在发酵液中的进一步积贮，为提高L-色氨酸产量、促进L-色氨酸工业出产打下基础。朱晓雯等[91]优化了大肠杆菌发酵出产L-色氨酸时使用的培养基，优化了补料时势，其产量达到24 g/L，提高了约35%；张震等[92]通过优化发酵接种量和底物磷酸二氢钾的添加量、使大肠杆菌在高密度发酵培养时副产物积贮减少，L-色氨酸产量提高约31.2%，并通过混菌发酵工艺，进一步减少了乙酸、乳酸等代谢副产物的积贮。

4.2 索取工艺优化

相较于化学法，由于发酵原料组成相对通俗且不含危急化学品，生物平直发酵法的索取物一般不错保证产物的安全性，但是仍然需要处置发酵液中产物含量较低的问题。连年来，从发酵液中索取和纯化L-色氨酸的工艺迟缓训练，所需资本更低，产物纯度更高，如苏建民[93]通过对发酵液进行分析后优化索取工艺和消失、响应、浓缩结晶等条款，最终将L-色氨酸分离提纯的收率提高到61%，大大缩短了出产L-色氨酸的资本，提高了经济效益。

5 总结与瞻望

现在关于大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌的色氨酸出产菌立异已取得了一定收效(图 6)，但是由于菌株对高浓度L-色氨酸的耐受机理不清，仍然无法较好地撤消L-色氨酸对菌株的生理毒性，由此变成的出产菌株出产强度、低菌株鲁棒性较差等问题是如今L-色氨酸工业化大限制出产濒临的主要贫苦。安妥进化自然实用性强盛韩国全色网，但是存在费时吃力等问题。因此，通过生物传感器联结安妥性进化的步伐不错灵验提高进化遵守，通过对出产菌株L-色氨酸耐受机理的久了商量、缩短L-色氨酸的毒性作用并找到将L-色氨酸高效排出菌体的步伐将促进感性代谢立异的进一步发展。同期，L-色氨酸的繁衍物(如滋长素、褪黑素等)具有较高的经济效益，但现在这些产物仍然主要依靠自然索取法等步伐获取，通过微生物发酵法得到这些繁衍物的报谈较少，距离工业化应用仍有相当长的距离，其中L-色氨酸在胞内浓度较低是导致这一表象的进军因素。但愿跟着L-色氨酸在胞内累积问题的处置和对L-色氨酸繁衍物的合成机理的迟缓澄澈，通过微生物发酵法出产相应繁衍物的步伐迟缓训练并在改日尽快得到应用。